乳、乳制品及飼料中三聚氰胺的測(cè)定
一．名詞簡(jiǎn)介
1. 三聚氰胺理化性質(zhì)
三聚氰胺：英文名“melamine”，簡(jiǎn)稱三胺，學(xué)名三氨三嗪，別名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺。分子式：C3N6H6、C3N3(NH2)3；分子量：126.12；物理性能：白色結(jié)晶粉末，無(wú)毒，無(wú)味；相對(duì)密度：1570kg/m³；熔點(diǎn)：在常壓下，354℃分解；升華溫度：300℃；溶解性：能溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶；微溶于水、乙醇；不溶于乙醚、苯和四氯化碳，水溶液呈弱堿性。
化學(xué)性能：三聚氰胺是一種重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料，顯弱堿性，能夠與各種酸反應(yīng)生成三聚氰胺鹽；在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿液中，三聚氰胺發(fā)生水解，胺基逐步被羥基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸；三聚氰胺與醛類反應(yīng)生成加成化合物；三聚氰胺與甲醛反應(yīng)制成樹(shù)脂，三聚氰胺樹(shù)脂是一種多種用途的材料，防火耐熱且有很高的穩(wěn)定性，用于生產(chǎn)塑料、地板磚，廚房用具，防火纖維，商業(yè)濾膜，膠水和阻燃劑。
2. 乳制品
是指以生鮮牛（羊）乳及其制品為主要原料，經(jīng)加工而制成的各種食品。本標(biāo)準(zhǔn)所指的乳制品包括液體乳類（殺菌乳、滅菌乳、酸牛乳、配方乳）、乳粉類（全脂乳粉、脫脂乳粉、全脂加糖乳粉和調(diào)味乳粉、嬰幼兒乳粉、其他配方乳粉）、含乳飲料類、煉乳類（全脂無(wú)糖煉乳、全脂加糖煉乳、調(diào)味煉乳；配方煉乳）、乳脂肪類（稀奶油、奶油、無(wú)水奶油）、干酪類（原干酪；再制干酪）、乳冰淇淋類（乳冰淇淋、乳冰）和其他乳制品類（干酪素、乳糖、乳清粉、濃縮乳清蛋白）等。
1. 原理
試樣經(jīng)溶解、超聲提取、沉淀蛋白、過(guò)濾得到測(cè)試液，經(jīng)液相色譜測(cè)定，根據(jù)保留時(shí)間和紫外吸收光譜定性，根據(jù)峰面積進(jìn)行定量。
2 試劑
方法中所用試劑，除另有規(guī)定外，均為分析純?cè)噭?，水?span>GB/T 6682-2008中一級(jí)用水，溶液為水溶液。
2.1 磺基水楊酸。
2.2 檸檬酸。
2.3 辛烷磺酸鈉：液相色譜離子對(duì)試劑。
2.4 乙腈：色譜純。
2.5 鹽酸。
2.6 60 g/L磺基水楊酸：稱取60 g磺基水楊酸用水定容至1 L。
2.7 0.1 mol/L鹽酸：量取8.3 mL鹽酸用水稀釋至1 L。
2.8 緩沖液：檸檬酸和辛烷磺酸鈉濃度均為10 mmol/L。
2.9 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：已知含量大于99%。
2.10 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品0.01g（準(zhǔn)確至0.0 001g），用甲醇配制成濃度為1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。
2.11 標(biāo)準(zhǔn)系列：將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用0.1 mol/L鹽酸逐級(jí)稀釋至0.25µg/mL，0.50µg/mL，1.00 µg/mL，2.00 µg/mL，4.00 µg/mL，5.00 µg/mL，10.0 µg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3 儀器成套性
3.1 液相色譜儀
3.1.1 P3000型 高壓輸液泵
3.1.2 UV3000紫外檢測(cè)器
3.1.3 Rehodyne手動(dòng)進(jìn)樣閥(20μl)
3.1.4 CXTH3000色譜工作軟件
3.1.5 ODS（VenusilASB-C18色譜柱） 250 mm×4.6 mm，5 µm
3.1.6 分析啟動(dòng)工具包
3.1.7 溶劑托盤(pán)
3.1.8 試劑包
3.1.9 保護(hù)柱和柱芯
3.1.10真空固相萃取裝置（含混合型的陽(yáng)離子交換柱10根）
3.2 溶劑過(guò)濾器（含真空泵）
3.3 超聲波清洗器
3.4 柱溫箱
3.5 高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速>4 000 r/min
3.6 旋渦混勻器
3.7 分析天平：感量0.1mg
4 樣品處理
4.1 固態(tài)乳制品
稱取1.0 g左右試樣（準(zhǔn)確至0.0 001 g），加入0.1 mol/L 鹽酸約15 mL，渦旋混勻，超聲提取30 min后加入60 g/L磺基水楊酸6 mL ~8 mL，用0.1 mol/L 鹽酸定容至25 mL，混勻后離心，上清液經(jīng)0.45 µm的微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。
4.2 液態(tài)乳制品（包含酸奶）
稱取15 g左右試樣（準(zhǔn)確至0.0 001 g），加入60 g/L磺基水楊酸3 mL~4 mL，用0.1 mol/L 鹽酸定容至25 mL，混勻后離心，上清液經(jīng)0.45 µm的微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。
4.3 飼料
稱取1.0g左右試樣（準(zhǔn)確至0.0 001 g），將樣品用研缽充分碾碎混勻，加入0.1 mol/L 鹽酸約15 mL，渦旋混勻，超聲提取30 min后加入60 g/L磺基水楊酸6 mL ~8 mL，用0.1 mol/L 鹽酸定容至25 mL，混勻后離心，上清液經(jīng)0.45 µm的微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。
5 測(cè)定步驟
5.1 色譜條件
5.1.1 色譜柱：ODS或C8，250 mm×4.6 mm，5 µm。
5.1.2 流動(dòng)相：緩沖液︰乙腈=85︰15。
5.1.3 流速：1.0 mL/min。
5.1.4 柱溫：40 ℃。
5.1.5 波長(zhǎng)：240 nm。
上述色譜條件是典型的，可根據(jù)實(shí)際情況做具體調(diào)整。如果分離效果不理想，將水相改為：檸檬酸和辛烷磺酸鈉濃度均為10 mmol/L，加3mL三氯乙酸，配制成1000mL溶液，流動(dòng)相用氨水調(diào)PH值3.9到3.95。
5.2 測(cè)定
5.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
將標(biāo)準(zhǔn)系列0.25µg/mL，0.50µg/mL，1.00 µg/mL，2.00 µg/mL，4.00 µg/mL，5.00 µg/mL，10.0 µg/mL分別進(jìn)樣20 µL,以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)作圖，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
5.2.2 樣品測(cè)定
取制備好的試樣溶液進(jìn)樣20 µL,進(jìn)行液相色譜分析。根據(jù)保留時(shí)間和紫外吸收光譜定性，根據(jù)峰面積進(jìn)行定量。三聚氰胺的標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖見(jiàn)圖1，液態(tài)奶樣品色譜圖見(jiàn)圖2，奶粉樣品色譜圖見(jiàn)圖3。
圖1 標(biāo)樣色譜圖
儀器：山東金普分析儀器有限公司LC3000
色譜柱：山東金普分析儀器有限公司ODS柱 250 mm×4.6 mm，5μm
流動(dòng)相：緩沖液︰乙腈=85︰15，用三氯乙酸調(diào)PH3.9
流速：1.0 mL/min
柱溫：40 ℃
波長(zhǎng)：240 nm
圖2 液態(tài)奶樣品色譜圖
儀器：山東金普分析儀器有限公司LC3000
色譜柱：山東金普分析儀器有限公司ODS柱 250 mm×4.6 mm，5μm
流動(dòng)相：緩沖液︰乙腈=85︰15，用三氯乙酸調(diào)PH3.9
流速：1.0 mL/min
柱溫：40 ℃
波長(zhǎng)：240 nm
圖3 奶粉樣品色譜圖
儀器：山東金普分析儀器有限公司LC3000
色譜柱：山東金普分析儀器有限公司ODS柱 250 mm×4.6 mm，5μm
流動(dòng)相：緩沖液︰乙腈=85︰15，用三氯乙酸調(diào)PH3.9
流速：1.0 mL/min
柱溫：40 ℃
波長(zhǎng)：240 nm
6 結(jié)果計(jì)算
6.1 計(jì)算
試樣中三聚氰胺的含量（mg/kg）按式（1）計(jì)算:
C×V
X = ————………………………………………………（1）
m
式中：X—樣品中三聚氰胺含量，mg/kg；
C—從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出的含量，µg/mL；
V—定容體積，mL；
m—稱樣量，g。
平行測(cè)定結(jié)果用算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
本文參考以下方法：
HPLC-UV檢測(cè)方法
三聚氰胺在傳統(tǒng)的C18柱上保留很差，需要用離子對(duì)試劑色譜方法才能有良好的保留與分離，按照美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的三聚氰胺檢測(cè)方法和中國(guó)農(nóng)業(yè)部頒部的三聚氰胺檢測(cè)方法，采用北京創(chuàng)新通恒科技有限公司的ODS，Ｃ１８色譜柱，能夠得到良好的結(jié)果。
1、 三聚氰胺的FDA檢測(cè)方法
色譜柱：山東金普分析儀器有限公司ODS 4.6×250mm
緩沖液：10mM檸檬酸，10mM辛烷磺酸鈉，調(diào)pH為3.0。
流動(dòng)相：緩沖液：乙腈=85：15
進(jìn)樣量：樣品用緩沖液溶解成約0.1mg/mL，進(jìn)10μL，
進(jìn)樣前用0.22μm針式過(guò)濾器過(guò)濾
流 速：1.0mL/min
柱 溫：40 ℃
波 長(zhǎng)：240nm
2、三聚氰胺的中國(guó)農(nóng)業(yè)部頒標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法
色譜柱：山東金普分析儀器有限公司ODS 4.6×250mm
緩沖液：10mM檸檬酸, 10mM庚烷磺酸鈉
流動(dòng)相：緩沖溶液:乙腈=85:15
進(jìn)樣量：樣品用緩沖液溶解成約0.1mg/mL，進(jìn)10uL
進(jìn)樣前用0.22μm針式過(guò)濾器過(guò)濾
流 速：1.0mL/min
柱 溫：40℃
波 長(zhǎng)：240nm
山東金普分析儀器有限公司 技術(shù)部
